de.mpg.escidoc.pubman.appbase.FacesBean

Post

 
 Vis
  Determination of leukocyte DNA 6-thioguanine nucleotides
Item is

Ophav

 Ophav:
Karen-Marie, Olesen1, Forfatter
Tilknytninger:
1Det Farmaceutiske Fakultet, Københavns Universitet, København, Danmark, diskurs:7016              
skjul Ophav
Vis Ophav

Indhold

Ukontrollerede emneord: -
 Abstract: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common form of childhood cancer with 35 new cases per year in Denmark. More than 80% of the children are cured by intensive cancer chemotherapy. 6-Mercaptopurine (6MP) has been used for more than 50 years and still constitutes an important part of the treatment of ALL. The efficacy of 6MP primarily depends upon a multistep transformation to the active 2’-deoxy-6-thioguanosine 5’-monophosphate (6TGN), which is cytotoxic after incorporation into DNA. Owing to large interindividual variations in the metabolism of 6MP the level of total 6TGNs (6-thioguanine (6TG), 6TGN, 6-thioguanosine 5’-diphosphate and 2’-deoxy-6-thioguanosine 5’-triphosphate) in erythrocytes (E-6TGN) has been applied to monitor therapy. But little is known of the correlation between E-6TGN and the incorporation of 6TGN into leukocyte DNA (DNA-6TGN) and the relation of DNA-6TGN to treatment efficacy. The aim of the work presented in this thesis was to establish an analytical method for determination of DNA-6TGN in small aliquots of blood (1-2 ml). Additionally, a cohort of 140 samples from children on 6MP therapy was analysed and the relationship between DNA-6TGN and E-6TGN was determined.
A HPLC method for determination of 6TGN-DNA was developed. Leukocyte DNA was isolated from peripheral blood, derivatized with chloroacetaldehyde and the formed etheno derivatives, etheno 6-thioguanine (ε6TG), 1,N6-etheno adenine (εA) and N2,3-etheno guanine (εG), were released from the DNA backbone by hydrolysis in potassium phosphate buffer (50 mM, pH 6.0) and heating at 80 °C for 60 min. After extraction of ε6TG by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC), where the sorbent was immobilized with cobber ions and the ε6TG was selectively eluted by a eluting solution consisting of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 2.5) and 0.5 M sodium chloride, ε6TG was analysed and quantified by ion-pair reversed-phase HPLC with fluorescence detection. The HPLC method employed a 100 mm x 2.0 mm i.d. Luna C18(2) column with a mobile phase consisting of water:methanol (95:5 v/v) with 0.5% heptafluorobutyric acid and fluorescence detection at 305 nm (excitation) and 445 nm (emission). The limit of quantification was 9.0 nM 6TG and the intra- and interday precision ranged from 2.8 to 15.5%. In order to quantify the amount of DNA εA was determined by another HPLC method using reversed-phase chromatography with UV detection at 275 nm. A 100 mm x 2.0 mm i.d. Luna C18(2) column and a mobile phase consisting of potassium phosphate buffer (0.1 M, pH 6.0):methanol (9:1 v/v) was used. The limit of quantification was 3.6 μM adenine and the intra- and interday precision ranged from 1.9 to 3.8%. The total recovery of ε6TG and εA was estimated to 75%.
In a cohort of 140 samples from children on 6MP therapy, a median of 6TG residues incorporated into leukocyte DNA was found to 695 pmol 6TG/μmol adenine (range, 103-2092 pmol 6TG/μmol adenine). It corresponded to a 6TG:nucleic acid base ratio of 1:1631 to 1:33087 (median, 1:4910). The incorporation of 6TGN into leukocyte DNA did not reflect the accumulation of 6TGNs in the erythrocytes. All patients were titrated to the same degree of leukopenia, which should reflect the DNA-6TGN rather than the E-6TGN. Future studies are needed to clarify the applicability of DNA-6TGN as a pharmacological parameter for toxicity and antileukemic efficacy and thus dose adjustments in children on 6MP maintenance therapy for ALL.
 Abstract: Akut lymfoblastær leukæmi (ALL) er med 35 nye tilfælde om året i Danmark den mest almindelige form for kræft hos børn. Med intensiv kemoterapi helbredes flere end 80% af børnene. 6-Mercaptopurin (6MP) har været anvendt i behandlingen af ALL i mere end 50 år og udgør stadig en vigtig del af behandlingen. Det aktive 2’-dexoy-6-thioguanin-5’-monofosfat (6TGN), som er cytotoksisk efter inkorporering i DNA, fås ved metabolisering af 6MP. På grund af stor interindividuel variation i metaboliseringen af 6MP monitoreres behandlingen ved at kvantificere totalt 6TGNs (6-thioguanin (6TG), 6TGN, 6-thioguanosin-5’-difosfat og 2’-deoxy-6-thioguanosin-5’-trifosfat) i erytrocytterne. Men der er begrænset viden om, hvordan korrelationen mellem 6TGN i erytrocytterne (E-6TGN) og inkorporeringen af 6TGN i leukocytternes DNA (DNA-6TGN) er, og hvilken indflydelse dette har på effekten af behandlingen af ALL. Formålet med denne afhandling har været at udvikle en metode til kvantificering af DNA-6TGN i en lille mængde blod (1-2 ml). Desuden er 140 prøver fra børn i behandling med 6MP analyseret og sammenhængen mellem DNA-6TGN og E-6TGN bestemt.
Der blev udviklet en HPLC-metode til kvantificering af DNA-6TGN. Leukocyt DNA blev isoleret fra perifert blod, derivatiseret med chloroacetaldehyd, og de dannede ethenoderivater, etheno-6-thioguanin (ε6TG), 1,N6-ethenoadenin (εA) og N2,3-ethenoguanin (εG) blev frigjort fra DNA-strengen ved hydrolyse i kaliumfosfatbuffer (50 mM; pH 6,0) og opvarmning til 80 °C i 60 min. Ved brug af immobiliseret metalion affinitetskromatografi (IMAC), hvor sorbentet var immobiliseret med kobberioner, blev ε6TG selektiv ekstraheret ved eluering med 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 2,5) indeholdende 0,5 M natriumklorid. Ved efterfølgende omvendtfase ionpar kromatografi med fluorescensdetektion blev ε6TG analyseret og kvantificeret.
Ved HPLC-metoden blev en Luna C18(2)-kolonne (100 mm x 2,0 mm i.d.) anvendt. Mobilfasen bestod af en blanding af vand:metanol (95:5 v/v) med 0,5% heptafluorsmørsyre. Fluorescencdetektoren målte ved en excitationsbølgelængde på 305 nm og en emissionsbølgelængde på 445 nm. Kvantificeringsgrænsen var 9,0 nM 6TG, og intra- og interdagpræcisionen varierede mellem 2,8 og 15,5%. For at kvantificere mængden af DNA blev εA analyseret ved brug af en anden omvendtfase HPLC-metode med UV-detektion ved 275 nm. Til dette formål blev en Luna C18(2)-kolonne (100 mm x 2,0 mm i.d.) anvendt, og mobilfasen bestod af kaliumfosfatbuffer (0,1 M; pH 6,0):metanol (9:1 v/v). Kvantificeringsgrænsen blev bestemt til 3,6 μM adenin, og intra- og interdagpræcisionen varierede fra 1,9 til 3,8%. Genfindingen af ε6TG og εA blev estiemeret til 75%. I alt 140 prøver fra børn i behandling med 6MP blev analyseret. Som median blev der fundet 695 pmol 6TG/μmol adenin (interval, 103-2092 pmol 6TG/μmol adenin), hvilket svarer til inkorporering af én 6TG pr. 4910 normale nukleinsyrebaser (interval, 1:1631 til 1:33087). Inkorporeringen af 6TGN i leukocyt DNA afspejlede ikke akkumuleringen af 6TGNs i erytrocytterne. Alle patienter var titreret til samme grad af leukopenia, hvilket bedre giver sig til udtryk i DNA-6TGN end i E-6TGN. Yderligere studier vil kunne give svar på, om DNA-6TGN er en bedre farmakologisk parameter for toksicitet og antileukæmisk effekt, og dermed også om DNA-6TGN er et bedre mål i lægemiddelmonitoreringen af 6MP hos børn i vedligeholdelsesbehandling
for ALL.
skjul Indhold
Vis Indhold

Filer

Bemærkninger:
Eksklusiv artikler
Tilgængelighed:
Offentlig
Mime-type / størrelse:
application/pdf / 881KB
Copyright dato:
2014-03-20
Copyright information:
De fulde rettigheder til dette materiale tilhører forfatteren.
skjul Filer
Vis Filer

Basal

Bogmærk denne post: https://diskurs.kb.dk/item/diskurs:59486:5
 Type: Ph.D.
Alternativ titel: method development and clinical application
skjul Basal
Vis Basal

Links

Vis Links

Detaljer

Sprog: English - eng
 Datoer: 2008-03
 Sider: 82 s.
 Publiceringsinfo: København : Københavns Universitet
 Indholdsfortegnelse: -
 Note: ISBN til trykte udgave: 978-87-9143-021-3
 Type: Ph.D.
skjul Detaljer
Vis Detaljer

Kilde

Vis Kilde