de.mpg.escidoc.pubman.appbase.FacesBean

Post

 
 Vis
  Lipoteichoinsyre-neutraliserende peptider
Item is

Ophav

 Ophav:
Bjørn Hansen, Simon1, Forfatter
Moesby, Lise2, Vejleder
Franzyk, Henrik3, Vejleder
Tilknytninger:
1Det Farmaceutiske Fakultet, Københavns Universitet, København, Danmark, diskurs:7016              
2Institut for Farmakologi og Farmakoterapi, Det Farmaceutiske Fakultet, Københavns Universitet, København, Danmark, diskurs:7018              
3 Institut for Lægemiddeldesign og Farmakologi, Københavns Universitet, København, Danmark, diskurs:18              
skjul Ophav
Vis Ophav

Indhold

Ukontrollerede emneord: -
 Abstract: Omkring halvdelen af tilfældene af sepsis forårsages i skrivende stund af Gram-positive bakterier. For denne type bakterier har der længe været diskussion om, hvilke dele af bakterien, der forårsager de proinflammatoriske reaktioner i immunsystemet, som kan føre til sepsis. Lipoteichoinsyre (LTA) er en vigtig del af den Gram-positive cellemembran, ligesom lipopolysaccharid (LPS) er det i den Gramnegative cellemembran. LTA og LPS er sammenlignelige strukturmæssigt, og de kan begge inducere sepsis. Begge stoffer frigives spontant i små mængder fra bakterier under cellevækst men i langt større grad ved celledød.
Formålet med projektet var at udvælge og syntetisere nogle få peptider, som allerede var beskrevet i litteraturen. Peptiderne skulle enten være påvist at kunne binde til LPS og/eller LTA eller være i stand til at neutralisere den proinflammatoriske effekt af LPS og/eller LTA. Ydermere skulle nogle få stoffer udvælges fra et eksisterende stofbibliotek. De syntetiserede samt de fra stofbiblioteket udvalgte stoffer skulle derefter testes i et cellebaseret assay, hvor produktionen af det proinflammatoriske cytokin, interleukin-6 (IL-6), blev målt efter stimulering af humane monocytiske celler fra cellelinjen, Mono Mac 6 (MM6), med LPS eller LTA. Derpå skulle det vurderes, om der var entydig sammenhæng mellem struktur og aktivit af stofferne.
Til syntese af de peptider, der blev udvalgt fra studier af litteraturen, blev en automatiseret Liberty mikrobølge-assisteret peptidsyntesemaskine anvendt. Peptiderne blev oprenset ved brug af præparativ højtydende væskekromatografi (eng.: high-performance liquid chromatography (HPLC)), mens renheden blev vurderet vha. analytisk HPLC og massespektrometri i høj opløsning (eng.: high-resolution mass spectrometry (HRMS)). Aktiviteten af de syntetiserede peptider samt de udvalgte stoffer fra det eksisterende stofbibliotek blev testet ved at stimulere MM6 celler med LTA eller LPS i kombination med hvert enkelt teststof, og derefter måle den inducerede IL-6 produktion. Teststoffernes toksicitet over for MM6 celler blev vurderet ud fra et tetrazoleum assay.
Fem peptider blev udvalgt på basis af litteraturstudier. Peptidsyntesen resulterede i udbytter på ca. 3-28% med renheder på ca. 90-100%. Peptiderne blev testet i MM6 assayet, hvor fire af de fem peptider havde lav aktivitet eller var inaktive ved den testede koncentration på 1 μM. Det sidste peptid hæmmede fuldstændigt LTA- og LPS-induceret IL-6 produktion i MM6 celler. Der blev udvalgt fire peptider og fem peptidomimetika fra et eksisterende stofbibliotek, som også blev testet i MM6 assayet.
Samtlige disse udvalgte stoffer udviste aktivitet. Af de fem peptidomimetika var fire palmitoylerede. Alle disse palmitoylerede peptidomimetika udviste aktivitet ved en koncentration på 100 nM. Ingen af de testede stoffer blev vurderet toksiske over for MM6 celler.
Alle de aktive stoffer var kationiske, og N-acylering medførte stærkt forøget aktivitet.
 Abstract: About half of all incidences of sepsis are at the time of writing caused by Gram-positive bacteria. It has for a long time been discussed which part of this type of bacteria it is that induces the proinflammatory reactions in the immune system that leads to sepsis. Lipoteichoic acid (LTA) is a major constituent of the
Gram-positive cell membrane just like lipopolysaccharide (LPS) is a major constituent of the Gramnegative cell membrane. LTA and LPS have comparable structures and both are able to induce sepsis.
Both compounds are liberated from bacteria spontaneously during cell growth and to a greater extent during cell death.
The purpose of the project was to identify a few peptides in the literature and synthesize these. The peptides should be shown to be able to bind LPS and/or LTA or to neutralize the proinflammatory effects of LPS and/or LTA. Furthermore, a few compounds should be picked out from an existing library.
Both the synthesized as well as those compounds picked out from the library should be tested in a cellbased
assay measuring the production of the proinflammtory cytokine, interleukin-6, as a consequence of stimulating the human monocytic cell line, Mono Mac 6 (MM6) with LPS or LTA. Then it should be evaluated whether there was an unambiguous connection between structural units and the activity of the compounds.
In order to synthesize the peptides identified in the literature, an automated Liberty microwave-assisted peptide synthesizer was used. The peptides were purified using preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) and the purity determined using analytical HPLC and high resolution mass spectrometry (HRMS). The activity of the synthesized peptides along with those compounds picked out
from the existing library was tested by stimulating MM6 cells with LTA or LPS in combination with the test compounds and measuring the induced IL-6 production. The toxicity of the tested compounds towards the MM6 cells was evaluated by using a tetrazoleum assay.
Five peptides were identified in the literature and chosen for synthesis. The peptide synthesis resulted in yields of approximately 3-28% with purities of approximately 90-100%. The peptides were tested in the MM6 assay where four of the five peptides had low or no activity at a concentration of 1 μM. The last peptide completely inhibited both LTA- and LPS-induced IL-6 production in MM6 cells. Four peptides and five peptidomimetics were picked out from an existing library and tested in the MM6 assay. All these compounds showed activity of varying degree.
Of the five peptidomimetics, four were palmitoylated. All of these palmitoylated peptidomimetics showed activity at a concentration of 100 nM. None of the tested compounds were rated toxic towards the MM6 cells.
All of the active compounds were cationic and N-acylation resulted in greatly enhanced activity.
skjul Indhold
Vis Indhold

Filer

Navn:
simon_hansen_speciale.pdf (Hovedtekst)
Bemærkninger:
Bilag mangler.
Tilgængelighed:
Offentlig
Mime-type / størrelse:
application/pdf / 2MB
Copyright dato:
2011
Copyright information:
De fulde rettigheder til dette materiale tilhører forfatteren.
skjul Filer
Vis Filer

Basal

Bogmærk denne post: https://diskurs.kb.dk/item/diskurs:12977:4
 Type: Speciale
Alternativ titel: Lipoteichoic acid-neutralizing peptides
skjul Basal
Vis Basal

Links

Vis Links

Detaljer

Sprog: Danish - dan
 Datoer: 2011-08-05
 Sider: iv, 56 s.
 Publiceringsinfo: København : Københavns Universitet
 Indholdsfortegnelse: -
 Note: -
 Type: Speciale
skjul Detaljer
Vis Detaljer

Kilde

Vis Kilde