de.mpg.escidoc.pubman.appbase.FacesBean

Post

 
 Vis
  Genetisk og elektrofysiologisk metode for karakterisering af K+-kanalerne KCNQ1 og KCNH2 med betydning for hjertets repolarisering hos hest
Item is

Ophav

 Ophav:
Juul Pedersen, Philip1, Forfatter
Klærke, Dan Arne1, Vejleder
Høier Olsen, Lisbeth1, Vejleder
Tilknytninger:
1Det Biovidenskabelige Fakultet, København, Danmark
skjul Ophav
Vis Ophav

Indhold

Ukontrollerede emneord: -
 Abstract: Action potential duration (APD) is prolonged correlated to animal size. This prolongation is due to a delayed effect of ion flow through the voltage-gated K+ channels responsible for repolarization (Rosati et al. 2008). These channels are membrane proteins build by four polypeptide a-subunits, each containing six transmembrane a-helix domains named S1-S6. A water filled pore is created in the channel core, which by far favours the transport of K+ ions when the channel is opened under depolarization (Guy & Seetharamulu 1986). How these channels are regulated and expressed precisely in large animals is to this date not well documented. The objective of this thesis is to test a genetic and electrophysiological method description for the characterization of the K+ channels KCNQ1 and KCNH2, which are primarily responsible for repolarization in the large equine heart (Finley et al. 2002). SMARTer and FirstChoice® RLM RACE PCR are chosen as basis for full length genetic sequencing. Two-electrode voltage clamp (TEVC) is used for electrophysiological characterisation of channels expressed in Xenopus oocytes. Coding sequences for the predicted equine KCNQ1 and KCNH2 a-subunit protein were identified with the help of bioinformatics. Analysis revealed 89 and 91 % homology between these and the human sequence. Statistical analysis of the predicted KCNH2 protein sequence turned out a striking similarity to the human protein regarding its positioning of transmembrane domains. By SMARTer 3’-RACE PCR it was possible to sequence a small 110 bp fragment (not including a stop codon), which had 97,3 % homology with the predicted sequence and 90,9 % homology with the human. It has not been possible to get positive SMARTer 5’-RACE PCR reactions. Likewise success with the RLM 5’-RACE PCR could also not be surely concluded. Despite that a 135 bp fragment from the 5’ end was sequenced, which had 100,0 % homology with the predicted sequence and 97,8 % homology with the human. From these results there is an indication that the equine KCNH2 protein is very similar to the human regarding size and amino acid sequence. This supports the idea that the horse expresses a channel very similar in kinetics to the human channel. Using TVEC it was possible to measure the human KCNQ1 and HERG1a K+ channels expressed in Xenopus oocytes. Expressing KCNQ1 with its regulatory ß-subunit KCNE1 was not successful. The current traces and their belonging IV-plots for KCNQ1 and HERG1a were all in accordance with previous published literature (Sale et al. 2008; Spector et al. 1996). The current traces obtained from the two channels being exposed to pulses ranging from 0,5 to 3,33 Hz revealed that neither of the channels supports an extra contribution to repolarization when expressed alone.
 Abstract: Varigheden af hjertets aktionspotentiale (APD) er positivt korreleret til dyrs størrelse. Den cellulære årsag til forlænget APD bunder i en forsinket repolariserende effekt af ionflowet gennem de spændingsregulerede K+-kanaler (Rosati et al. 2008). Disse er specialiserede integrale membranproteiner, der består af fire polypeptid a-subunits med hver seks transmembrane a-helix segmenter benævnt S1-S6. Disse danner en vandfyldt pore, indeholdende et selektionsfilter, der når kanalen åbnes under depolariseringen favoriserer K+-ionens passage (Guy & Seetharamulu 1986). Hvorledes disse kanaler præcist reguleres og udtrykkes hos de store dyr og giver anledning til de forlængede aktionspotentialer, er i dag ikke veldokumenteret. Formålet med denne opgave er at teste en genetisk og elektrofysiologisk metode for karakterisering af de primære repolariserende K+-kanaler KCNQ1 og KCNH2 hos hesten, som model for de store dyr. SMARTer og FirstChoice® RLM RACE PCR er valgt som udgangspunkt for fuldlængde genetisk sekventering. Two-electrode voltage clamp (TEVC) er benyttet til elektrofysiologisk karakterisering af kanaler udtrykt i et heterologt ekspressionssystem i form af Xenopus oocytter. Det lykkedes ved hjælp af bioinformatiske værktøjer at identificere en foreslået kodende gensekvens for både det equine KCNQ1 og KCNH2 a-subunit protein. Videre analyse af disse sekvenser afslørede, at de havde henholdsvis 89 og 91 % homologi med den humane nukleotidsekvens. Videre arbejde med den foreslåede equine KCNH2-proteinsekvens viste ved statistisk analyse, at denne havde en slående lighed med den humane sekvens, hvad angår placering af transmembrane domæner i proteinsekvensen. Ved succesfuld SMARTer 3’-RACE PCR er det lykkedes at sekventere et 110 bp stykke fra 3’-enden (uden stopkodon), som havde 97,3 % homologi med den foreslåede equine sekvens og 90,9 % homologi med den humane. Det har ikke været muligt at få positive RACE PCR-reaktioner med 5’-SMARTer RACE. Ligeledes er der tvivl om, hvorvidt der er opnået en succesfuld udførelse af RLM 5’-RACE PCR. Der er dog sekventeret et 135 bp stykke fra 5’-enden med 100 % homologi med den foreslåede equine sekvens og 97,8 % homologi med den humane. Der er altså en klar indikation af, at det equine KCNH2 a-subunit protein er meget lig det humane både i størrelse og aminosyresammensætning, og at hesten derfor udtrykker en kanal med kinetiske egenskaber meget lig den humane. Det er lykkedes at udtrykke og måle på de humane K+-kanaler KCNQ1 og HERG1a udtrykt i Xenopus oocytter ved hjælp af TEVC. Det er ikke lykkedes at udtrykke KCNQ1 sammen med dens regulatoriske ß-subunit KCNE1. De optagne strømspor og dertilhørende IV-kurver for KCNQ1 og HERG1a er i god overensstemmelse med de i litteraturen beskrevne (Sale et al. 2008; Spector et al. 1996). Strømsporene for KCNQ1 og HERG1a udsat for pulsrater fra 0,5 til 3,33 Hz viser, at kanalerne ikke giver yderligere repolariserende bidrag ved høje pulsrater, når de udtrykkes alene.
skjul Indhold
Vis Indhold

Filer

Navn:
Speciale_V9566.pdf (Hovedtekst)
Bemærkninger:
-
Tilgængelighed:
Offentlig
Mime-type / størrelse:
application/pdf / 6MB
Copyright dato:
-
Copyright information:
De fulde rettigheder til dette materiale tilhører forfatteren.
skjul Filer
Vis Filer

Basal

Bogmærk denne post: https://diskurs.kb.dk/item/diskurs:12542:1
 Type: Speciale
Alternativ titel: A genetic and electrophysiologic method desciption for the caracterization of the K+ channels KCNQ1 and KCNH2: key players in equine cardiac repolarization
skjul Basal
Vis Basal

Links

Vis Links

Detaljer

Sprog: Danish - dan
 Datoer: 2010
 Sider: 90 pages
 Publiceringsinfo: København, Danmark : Institut for Basal Husdyr- og Veterinærvidenskab
 Indholdsfortegnelse: -
 Note: Veterinary Medicine, Veterinærmedicin
 Type: Speciale
skjul Detaljer
Vis Detaljer

Kilde

Vis Kilde