de.mpg.escidoc.pubman.appbase.FacesBean

Post

 
 Vis
  Validering af Monocyt-aktiveringstest til måling af Interleukin-1 receptor antagonist som readout i Mono Mac 6-celler
Item is

Ophav

 Ophav:
Panah, Mahnaz Ayadi1, Forfatter
Moesby, Lise2, Vejleder
Wind Hansen, Erik2, Vejleder
Tilknytninger:
1Det Farmaceutiske Fakultet, Københavns Universitet, København, Danmark, diskurs:7016              
2Institut for Farmakologi og Farmakoterapi, Det Farmaceutiske Fakultet, Københavns Universitet, København, Danmark, diskurs:7018              
skjul Ophav
Vis Ophav

Indhold

Ukontrollerede emneord: -
 Abstract: I dette speciale er et sandwich immunoassay til måling af IL-1ra som readout etableret og valideret. Mængden af IL-1ra måles med non-kompetitivt Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescence Immunoassay (DELFIA).
Immunoassayet skal anvendes til at måle IL-1ra udskilt fra Mono Mac 6-celler (MM6). Interferens i immunoassayet samt den optimale koncentration for capture-antistoffet (monoklonal anti-human IL-1ra) er undersøgt. For at validere IL-1ra som readout er MM6-celler aktiveret med et cellevæg-komponent fra gramnegative og grampositive bakterier samt gær. Det drejer sig om lipopolysakkarid (LPS) i koncentrationerne 100-106 pg/ml, lipoteichoinsyre (LTA), peptidoglycan (PGN) og zymosan i koncentrationerne 100-107 pg/ml.
Aktivering er målt som udskilt IL-1ra.
Der er optegnet standardkurver med IL-1ra koncentration på abscisseaksen og fluorescens counts på ordinataksen for capture-antistof koncentrationerne 2 μg/ml, 3 μg/ml 4 μg/ml og 5 μg/ml. Det viste sig, at ved anvendelse af 4 μg/ml captureantistof opnås en lineær sammenhæng mellem IL-1ra koncentration og fluorescens counts med kvadratkorrelationskoefficient r2≥0,98 og variationskoefficient CV%≤20 for IL-1ra standard triplebestemmelser i intervallet 250-5.000 pg/ml IL-1ra. Det etablerede immunoassay har en inter-assay præcision på 8 %, en recovery på 100 % og en detektionsgrænse på 100 pg/ml. Immunoassayet har ingen interferens, fordi der ikke er observeret en signifikant forskel mellem koncentration af IL-1ra efter korrigering for fortyndingsfaktorerne i fortyndede supernatanter i forhold til IL-1ra-koncentration i ufortyndede supernatanter.
Der er fremstillet dosis-responskurver for aktivering af LPS, LTA, PGN og zymosan med dosis. på abscisseaksen og den udskilte IL-1ra på ordinataksen. For at inducere en signifikant IL-1raudskillelse kræves 104 pg/ml LPS, hvilke er 2.000 gange højere sammenlignet med IL-6. LTAmedieret IL-1ra-udskillelse medførte ingen dosis-afhængig IL-1ra-udskillelse i det undersøgte koncentrationsområde. For PGN-medieret IL-1ra-udskillelse kræves 106 pg/ml PGN, hvilke er 20 gange højere end IL-6. Der observeres ikke en dosisafhængig respons for IL-1ra-udskillelse efter stimulering med zymosan i det undersøgte koncentrationsområde. Sammenlignet med IL-6 har MM6-celler en IL-1 basaludskillelse 20 gange højere end IL-6 (1.000 pg/ml).
 Abstract: In this master thesis a sandwich immunoassay for measurement of IL-1ra as readout is established and validated. The amount of IL-1ra is measured with non-competitive Dissociation-Enhanced Fluorescence Lanthanides Immunoassay (DELFIA). The immunoassay is used to measure IL-1ra secreted from Mono Mac 6 (MM6) cells. Interference in immunoassay, as well as
optimal concentration of capture antibody (monoclonal anti-human IL-1ra) is studied. To validate the IL-1ra as readout MM6-cells are activated by a cell wall component from gram-negative and gram-positive bacteria and yeast. It is about Lipopolysakkarid (LPS) in concentrations 100-106 pg/ml, Lipoteichoinsyre (LTA), Peptidoglycan (PGN) and Zymosan in concentrations 100-107 pg/ml. Activation is measured as secreted IL-1ra.
Standard curves are made showing IL-1ra concentration at the abscissa and the fluorescence counts at the ordinate for capture antibody concentrations 2 μg/ml, 3 μg/ml, 4 μg/ml and 5 μg/ml.
It appeared that by using 4 μg/ml capture antibody a linear relationship between IL-1ra concentration and fluorescence counts with square correlation coefficient r2≥ 0.98 and coefficient of variation CV%≤ 20 for IL-1ra standard triplicates in the range 250-5.000 pg/ml IL-1ra is obtained. The established immunoassay has an inter-assay precision of 8%, a recovery of 100% and a detection limit of 100 pg/ml. Immunoassay has no interference, because no significant difference between adjusted IL-1ra concentration in diluted supernatants were observed compared with IL-1ra concentration in undiluted supernatants.
Dose-response curves for activation of LPS, LTA, PGN and zymosan were plotted, showing dosis at the abscissa and the secreted IL-1ra at ordinate. To induce a significant secretion of IL-1ra it requires 104 pg/ml LPS, which is 2.000 times higher compared with IL-6. LTA-mediated IL-1ra secretion did not result in dose dependent response in the tested concentration range.
PGN-mediated secretion of IL-1ra requires 106 pg/ml PGN, which is 20 times higher than IL-6.
No dose dependent response was observed for secretion of IL-1ra after stimulation with zymosan in the tested concentration range. Compared to IL-6, MM6 cells have an IL-1 basal release 20 times higher than IL-6 (1.000 pg/ml).
skjul Indhold
Vis Indhold

Filer

Navn:
Mahnaz_A_Panah_speciale.pdf (Hovedtekst)
Bemærkninger:
-
Tilgængelighed:
Offentlig
Mime-type / størrelse:
application/pdf / 2MB
Copyright dato:
2011
Copyright information:
De fulde rettigheder til dette materiale tilhører forfatteren.
skjul Filer
Vis Filer

Basal

Bogmærk denne post: https://diskurs.kb.dk/item/diskurs:12134:3
 Type: Speciale
Alternativ titel: Validation of Monocyte-activation test for measurement of Interleukin-1 receptor antagonist as readout in Mono Mac 6 cells
skjul Basal
Vis Basal

Links

Vis Links

Detaljer

Sprog: Danish - dan
 Datoer: 2011
 Sider: vi, 60 s.
 Publiceringsinfo: København : Københavns Universitet
 Indholdsfortegnelse: -
 Note: -
 Type: Speciale
skjul Detaljer
Vis Detaljer

Kilde

Vis Kilde