Glutamatergic neurotransmission under physiological and diabetic conditions
Item is


Sickmann, Helle Mark1, Forfatter
1Det Farmaceutiske Fakultet, Københavns Universitet, København, Danmark, diskurs:7016              
skjul Ophav
Vis Ophav


Ukontrollerede emneord: -
 Abstract: The contribution of energy‐producing pathways important for several processes related to glutamatergic neurotransmission was explored in the present PhD thesis. In addition, brain energy metabolism in prediabetic
and type 2 diabetic animals was investigated. In all studies, the specific involvement of brain glycogen in sustaining energy homeostasis was in focus. To study the role of glycogen in sustaining brain energy metabolism it is important to have a selective pharmacological tool. One aim of the present PhD project was therefore to characterize 1,4‐dideoxy‐1,4‐imino‐arabinitol (DAB) as a glycogen phosphorylase (GP) inhibitor in brain preparations. In cultured astrocytes DAB was shown to be a valid GP inhibitor in a
concentration range of 300‐1000 μM.
Glutamatergic neurotransmission is associated with several energy requiring processes in both neurons and astrocytes. For instance, packaging of glutamate into synaptic vesicles, maintenance of the exocytotic
machinery as well as restoration of ion gradients and removal of glutamate from the synaptic cleft are vital for optimal neurotransmitter signaling. Degradation of brain glycogen combined with glycolysis yields
energy, and glycogen has previously been shown to be important for maintaining neuronal activity. However, the involvement of glycogen in sustaining glutamatergic neurotransmission is at present unclear.
Furthermore, to what degree energy derived from glycogen degradation is utilized by astrocytes themselves or is transferred to neurons in the form of lactate for oxidative metabolism is unclear.
Therefore the role of glycogen metabolism in supporting glutamate uptake was studied in cultured cerebellar astrocytes. Furthermore, an objective was to investigate whether energy derived from the
degradation of glycogen was important for neuronal vesicular release as well as transport of glutamate in both neurons and astrocytes. Vesicular release was induced by repetitive exposure to N‐methyl‐Daspartate
(NMDA, 300 μM) in co‐cultures of cerebellar neurons and astrocytes. The results showed that glycogen provides energy to maintain optimal neuronal vesicular glutamate release as well as transport of
glutamate into astrocytes. Accordingly, glycogen is important for both the neuronal and astrocytic compartment.
It has been debated whether the energy‐generating pathways glycolysis or oxidative metabolism sustain glutamate transport in astrocytes. Studies in cultured astrocytes were undertaken to shed further light on
this issue. Glutamate transport is driven by the Na+ gradient and it is thus energy requiring via Na+/K+‐
ATPase. Uptake of D‐[3H]aspartate into astrocytes was investigated and homo‐exchange of preloaded D‐
[3H]aspartate induced by repetitive stimulation of D‐aspartate (1 mM) was employed as another experimental approach. The homo‐exchange process of D‐[3H]aspartate/D‐aspartate could be blocked by
DL‐treo‐benzyloxyaspartate (DL‐TBOA, 1 mM), a glutamate transport inhibitor. Iodoacetate (IA, 1 mM) and fluoroacetate (FA, 3 mM) were used as tools to inhibit glycolysis and TCA cycle/oxidative phosphorylation,
respectively in both experimental paradigms. Also, the roles of different energy substrates, i.e. glucose, acetate, lactate and pyruvate, was tested. Inhibiting the TCA cycle had a small effect on the homo‐exchange
of D‐[3H]aspartate/D‐aspartate, whereas IA markedly increased the release of preloaded D‐[3H]aspartate, indicating that glutamate transporters reversed when glycolysis was inhibited. Moreover, lactate and
pyruvate could not sustain this transport process, further strengthening the importance of glycolysis in maintaining glutamate transport capacity. To elucidate this further, synapto‐gliasomes were prepared, and
western blot analysis of vesicles from these indicated that the glycolytic enzyme glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase was present in the vesicle membrane fraction and strengthened the hypothesis
that ATP from glycolysis may be important for the function of the Na+/K+‐ATPase linked to the transport of glutamate in astrocytes.
Finally, we investigated brain energy metabolism in non‐diabetic, pre‐diabetic and type 2 diabetic animals,with focus on the specific involvement of brain glycogen. A hallmark of diabetes mellitus is decreased
insulin synthesis and/or increased insulin receptor resistance, which consequently affect peripheral glucose metabolism. The brain is highly dependent on glucose supply, and such peripheral alterations may
therefore affect brain energy metabolism in diabetes. At present, limited information exists about this.
Therefore, [1‐13C]glucose was used as a tool to investigate brain energy metabolism in normal rats (Sprague Dawley rats, SprD) as well as in a pre‐diabetic rat model (Zucker Obese rats, ZO) and a type 2 diabetic rat
model (Zucker Diabetic Fatty rats, ZDF). In addition, a GP inhibitor (CP‐316,819) was used to evaluate the specific involvement of glycogen‐derived energy in this respect. Glycogen concentrations in cerebral cortex
were increased in both diabetic animal models. Enrichment in blood glucose 13C‐1 was lower in the ZDF rat, and molecular carbon labeling (MCL) in glutamate, GABA, glutamine, aspartate and alanine was also
decreased. Inhibiting glycogen degradation had multiple effects on glycolytic activity in the animal models, indicating that the role of brain glycogen may be altered in the pre‐diabetic and type 2 diabetic states.
 Abstract: Glutamaterg neurotransmission er associeret med forskellige energikrævende processer og formålet med denne afhandling var at undersøge, hvilke energidannende omsætningsveje, der bidrager til opretholdelse af denne neurotransmission. Desuden blev hjernens energiomsætning i dyremodeller for præ‐diabetes samt type 2 diabetes undersøgt. For alle studier var der speciel fokus på, hvorvidt hjernens glykogen var involveret i opretholdelse af energihomeostasen.For at kunne undersøge glykogens rolle i hjernen er det vigtigt at have et specifikt farmakologisk redskab. Et af formålene med denne afhandling, var at karakterisere 1,4‐dideoxy‐1,4‐imino‐arabinitol (DAB) som en glykogen phosphorylase (GP) hæmmer i hjerne præparationer. I dyrkede astrocytter viste DAB sig at være en pålidelig GP hæmmer i et koncentrationsområde på 300 – 1000 μM.
Glutamaterg neurotransmission er kombineret med flere energikrævende processer i både astrocytter og neuroner. For eksempel er pakningen af glutamat i synaptiske vesikler, opretholdelse af det exocytotiske maskineri, genoprettelse af ion gradienter samt fjernelse af glutamat fra den synaptiske kløft energikrævende processer og meget essentielle for optimal neurotransmitter signalering. Nedbrydning af glykogen via glykolysen er energiproducerende, og glykogen har tidligere vist sig at være vigtig for opretholdelsen af neuronal aktivitet. Det er dog endnu uvist, hvilken rolle glykogenomsætningen specifikt har for vedligeholdelsen af glutamaterg neurotransmission. Desuden er det ikke klarlagt, i hvilken grad astrocytter henholdsvis neuroner forbruger den energi, der dannes via nedbrydningen af glykogen, idet glykogens nedbrydningsprodukt laktat kan overføres til neuroner med efterfølgende oxidativ omsætning.
Glykogenomsætningens betydning for optagelse af glutamat blev undersøgt i dyrkede astrocytter. Ydermere var det ved hjælp af co‐kulturer af cerebellare astrocytter og neuroner formålet at undersøge, om omsætningen af glykogen bidrog med energi til vesikulær frisætning i neuroner samt transport af glutamat i neuroner og astrocytter. Vesikulær frisætning blev induceret med N‐methyl‐D‐aspartat (NMDA,300 μM). Resultaterne viste, at glykogen er vigtigt for optagelse af glutamat i astrocytter. Tilmed viste det sig, at hjernens glykogenomsætning bidrager med energi til opretholdelse af glutamaterg neurotransmission, dvs til vesikulær frisætning samt transport af glutamat. Dermed er hjernens glykogen omsætning vigtig for både neuroner og astrocytter.
Det har været debatteret hvorvidt det er energien, der produceres via glykolysen eller via den oxidative omsætning, som opretholder glutamattransport i astrocytter. Studier på dyrkede astrocytter blev anvendt til at undersøge dette aspekt yderligere. Transport af glutamat drives af Na+‐gradienten og er derfor en energikrævende proces via Na+/K+‐ATPasen. Der blev anvendt to forskellige eksperimentelle strategier; optagelse af D‐[3H]aspartat samt frisætning af præinkuberet D‐[3H]aspartat induceret ved gentagen stimulation med D‐aspartat (1 mM). Udvekslingen mellem D‐[3H]aspartat og D‐aspartat kunne blokeres af glutamattransport‐hæmmeren DL‐treo‐benzyloxyaspartat (DL‐TBOA, 1 mM). Iodacetat (IA, 1 mM) eller fluoroacetat (FA, 3 mM) blev anvendt som redskaber til at hæmme henholdsvis glykolyse og TCAcyklus/oxidativ phosphorylering. Desuden blev effekten af forskellige energisubstrater såsom glukose, acetat, laktat og pyruvat undersøgt. Hæmning af TCA‐cyklus havde kun en lille effekt på udvekslingen af D‐ [3H]aspartat/D‐aspartat. Derimod forøgede IA markant frisætningen af præinkuberet D‐[3H]aspartat, hvilket indikerer at glutamattransporten ikke kan opretholdes, når glykolysen hæmmes. Desuden kunne hverken laktat eller pyruvat opretholde glutamattransportprocessen, og det bekræfter derfor at glykolyse er vigtig til at opretholde glutamattransport. Western blot af vesikler fra synapto‐gliasomer indikerede, at det glykolytiske enzym glyceraldehyd‐3‐phosphat dehydrogenase var lokaliseret i membranen af vesiklerne.
Dermed styrkes hypotesen om, at glykolytisk ATP kan være vigtigt for funktionen af Na+/K+‐ATPasen, der er koblet til transporten af glutamat i astrocytter.
Endeligt blev hjernens energiomsætning i ikke‐diabetiske, præ‐diabetiske samt type 2 diabetiske dyremodeller undersøgt, med speciel fokus på glykogenmetabolismens indflydelse på hjernens energiomsætning. Et kendetegn ved diabetes mellitus er nedsat insulin syntese samt øget insulin receptor resistens, hvilket påvirker den perifere glukoseomsætning. Hjernen er afhængig af kontinuerlig glukosetilførsel. Det er muligt, at disse perifære forandringer i forbindelse med forstadiet til diabetes samt udviklet type 2 diabetes påvirker hjernens energiomsætning. Det er endnu uvist om hjernens glykogenomsætning er forandret i den præ‐diabetiske og type 2 diabetiske tilstand. [1‐13C]Glukose blev anvendt som redskab til at undersøge hjernens energiomsætning i normale (Sprague Dawley, SprD) rotter samt i præ‐diabetiske (Zucker Obese, ZO) og type 2 diabetiske (Zucker Diabetic Fatty, ZDF) rotter. Ydermere
blev en GP hæmmer anvendt til specifikt at undersøge glykogen metabolismens betydning for hjernens energiomsætning. Koncentrationerne af glykogen i cerebrale cortex var øget i begge diabetiske dyremodeller. Den procentvise indmærkning i [1‐13C]glukose i blodet var lavere i ZDF rotten og den molekylære carbon indmærkning (MCL) i glutamat, GABA, glutamine, aspartate og alanine var ligeledes nedsat. Hæmning af glykogen nedbrydningen havde meget forskellig effekt på den glykolytiske aktivitet i de tre dyremodeller, hvilket kan indikere, at glykogenomsætningen i hjernen er forandret som en konsekvens af den præ‐diabetiske og type 2 diabetiske tilstand.
skjul Indhold
Vis Indhold


helle_sickmann_phd.pdf (Hovedtekst)
Webversion: eksklusiv artikler
Mime-type / størrelse:
application/pdf / 3MB
Copyright dato:
Copyright information:
De fulde rettigheder til dette materiale tilhører forfatteren.
skjul Filer
Vis Filer


Bogmærk denne post:
 Type: Ph.D.
Alternativ titel: involvement of brain glycogen
skjul Basal
Vis Basal


Vis Links


Sprog: English - eng
 Datoer: 2009
 Sider: 81 s.
 Publiceringsinfo: København : Københavns Universitet
 Indholdsfortegnelse: -
 Note: Bilag ikke inkluderet i webversion
 Type: Ph.D.
skjul Detaljer
Vis Detaljer


Vis Kilde